呼吸系统疾病的诊断方法

人体的呼吸道与外界相连，感染病原体的种类非常复杂，涵盖细菌、真菌、病毒，甚至寄生虫感染。下呼吸道感染（LRTI）是世界上最常见的传染病之一。呼吸道感染引起的肺炎是人群发病和死亡的重要原因，通常对老年人和免疫功能低下人群产生重大影响。尽管有多种实验室诊断方法可供使用，但约40%需要住院治疗的社区获得性肺炎（CAP）患者仍然难以诊断病原菌。因此，提高实验室诊断的准确性和有效性具有重要意义。包括培养在内的传统检测方法在不断改进的同时，仍然被认为是病原体检测的“金标准”。近年来分子生物学诊断技术的发展已广泛应用于呼吸道病原体的微生物诊断。
呼吸道感染病原检测技术发展及临床应用现状
1.1 传统呼吸道病原体检测方法
1.1.1 涂片染色镜检 (1) 染色方法很多，常用的有革兰氏染色和抗酸染色。革兰氏染色可用于区分革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌，操作简便。有报道称，革兰氏染色法检测球菌性肺炎病例的敏感性仅为80%左右，特别是对于CAP人群中肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的感染。抗酸染色可以突出显示染成红色的细长杆状细菌，对分枝杆菌具有较高的诊断特异性（90%至100%），但敏感性有限。其他染色方法，如墨水染色，对隐球菌具有较高的诊断特异性，特别适合脑脊液样本中隐球菌的染色。但其敏感性较差，应与隐球菌荚膜多糖抗原试验结合使用。六胺银染色适用于经典真菌和肺炎耶尔森氏菌的染色。痰液和支气管肺泡灌洗液样本中真菌感染最常用的诊断方法是使用荧光素偶联单克隆抗体进行荧光染色。 (2)显微镜观察细胞病理效应是培养鉴定病毒的重要手段。如果呼吸道样本细胞中发现染色的碱性包涵体，即可诊断为腺病毒感染。感染细胞的病理作用包括巨细胞、合胞体的形成和细胞内包涵体。显微镜检查对特定检测项目特异性较高，但费时费力。近年来，作为临床诊断实验，已逐渐被分子生物学所取代。
1.1.2 抗原检测方法
是指利用已知的病原体抗体来检测患者体内是否存在相应病原体抗原的方法。常见的操作方法有乳胶凝集试验、胶体金免疫层析、直接荧光抗体试验（DFA）等。作为流感快速检测的首选方法，可检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等。使用方便，特异性高（90%～95%），但敏感性低（40%～70%），这意味着阴性结果不能排除流感病毒感染。 DFA可以检测腺病毒、呼吸道合胞病毒等，特异性较高，但对结果的解释可能具有主观性，对专业要求较高。隐球菌感染的首选诊断方法是利用血清和脑脊液样本进行乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测隐球菌荚膜多糖抗原。军团菌肺炎的检测可通过尿液军团菌I型抗原检测与痰琼脂培养相结合来诊断。一种检测尿液中肺炎球菌抗原的新型免疫层析方法用于诊断肺炎球菌肺炎。值得注意的是，很多患者在样本检测时就已经开始抗生素治疗，很可能样本中无法培养出细菌，但体内仍然存在抗原。因此，抗原检测方法弥补了染色显微镜和传统培养方法在这方面的缺陷。
1.1.3 栽培方法
痰标本和支气管肺泡灌洗液标本一般在血平板、巧克力平板、麦康凯平板等上接种培养，如果怀疑有血行感染，则在血培养瓶中培养病原体。临床上还可针对不同病原微生物选择专用培养基。使用BCYE选择性培养基培养呼吸道分泌物是检测军团菌感染的金标准，特异性高，但敏感性较低（50%～80%）。此外，BCYE还可用于诺卡氏菌的培养。诊断侵袭性曲霉病最明确的方法是从正常无菌部位获得阳性培养结果，通常使用沙氏培养基，但敏感性较低。
1.1.4 血清学鉴定
是指利用免疫学检测方法和原理，检测患者体内是否存在针对已知病原微生物的抗体，以诊断感染。临床常见操作方法包括补体结合试验（CFT）、ELISA、颗粒凝集试验、荧光抗体试验（FA）等。病原体特异性抗体通常在初次感染后2周左右出现，可通过血清学检测。在引入分子生物学检测之前，病毒性呼吸道感染的主要诊断方法主要基于血清学，包括检测大量抗体升高和补体结合试验。对支原体和衣原体等非典型微生物的鉴定表明，感染上述微生物之一的最可靠的血清学证据需要急性和恢复血清样品之间的免疫球蛋白 G 抗体滴度增加四倍。总体而言，随着分子生物学的广泛发展，抗体检测在呼吸道感染病原学诊断中的价值正在不断减弱。
1.1.5 质谱分析方法
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）主要用于临床培养中阳性菌株的鉴定，包括细菌和真菌，特别是生长缓慢的分枝杆菌和各种真菌，具有快速、快速的优点。并准确识别。但MALDI-TOF MS灵敏度有限，一般不用于直接检测呼吸道原始样本中的病原微生物，无法缩短耗时的培养时间。
1.2 分子生物学检测方法
1.2.1 聚合酶链式反应（PCR）检测 PCR主要包括常规PCR、实时荧光定量PCR（RT-PCR）和数字PCR。 RT-PCR广泛应用于临床并被许多人广泛了解。数字PCR中应用最广泛的方法是液滴数字PCR。系统在PCR扩增前将测试样品分割成无数个水滴中的油滴，分割后每个液滴成为一个独立的PCR反应系统。理论上可以实现病原微生物的绝对定量，大大提高PCR灵敏度。 PCR对于大多数病原微生物的临床应用价值已被证实：（1）当样本量大于10万个微生物时，核酸探针对结核分枝杆菌复合群群的敏感性和特异性可接近100%； （2）对于流感病毒的检测，PCR因其灵敏度高、特异性强、检测时间窗大、周转时间快等优点，成为首选检测方法，取代抗原检测； （3）PCR对于呼吸机相关性肺炎患者支气管肺泡灌洗液样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）的检测具有优异的预测价值。
1.2.2 多重快速PCR检测
主要利用多个引物对不同病原体核酸或抗性基因进行特异性扩增，可同时检测同一样本中细菌、病毒、支原体等临床常见病原体及其抗性基因。在欧美等发达国家应用广泛，如Curetis Unvvero P50、Xpert、eSensor、FilmArray等。检测时间极短（如Xpert检测呼吸道病毒可在30分钟内完成），操作简单，但成本高。目前多重检测的优点是增加了识别呼吸道感染微生物病原体的机会，并且当存在共同感染时，可以在单个时间点检测到不止一种病原体。病毒的分子检测并不一定表明感染，而是取决于被检测个体的状况和病原体的类型。多重PCR的技术难点：（1）引物和探针的设计需要保持良好的灵敏度和特异性，并采用特殊技术避免引物和探针之间的结合。同时，还需要在操作平台上实现样本处理、核酸提取、扩增、结果判读等全自动化步骤，这确实给制造商带来了技术挑战。 (2)多重PCR的靶标设计也是一个重要问题。设置过多的项目，纳入临床罕见病原菌，不仅增加了产品设计的难度，也增加了医疗负担和患者的承受能力。对于多重PCR阳性结果，应根据患者的具体情况和病原微生物的致病性进行综合判断。鼻病毒可以定植于健康个体的鼻咽部，而甲型流感病毒很少这样做。
1.2.3
基于高通量测序技术的病原核酸检测第二代测序（NGS）技术的发展，为传染病临床诊断带来了突破。临床病原微生物NGS检测主要采用宏基因组二代测序（mNGS）技术。 mNGS的主要原理是对提取的病原微生物基因组DNA/RNA进行反转录和扩增，然后将其随机断裂成DNA小片段，并进行文库构建和机器测序等实验过程。最后生成测序数据，由专业人员进行数据分析和结果报告。临床上，mNGS可以准确分析患者样本中的所有微生物，对于传染病病原体的研究具有很高的应用价值。对于细菌检测，mNGS技术不仅可以定量鉴定病原菌，还可以获取病原菌的基因分型、耐药基因、进化水平、感染途径等关键信息，指导临床病原诊断、疾病防控、疫苗研发等。对于病毒检测，如新型冠状病毒，mNGS可以准确获取病毒亚型和耐药性进化信息，对于疫情的控制、检测和疫苗研发具有重要意义；对于真菌检测，弥补了传统培养方法检测速度慢、灵敏度低等缺点，为临床快速检测真菌提供了有力手段。因此，mNGS 提供了一种公正的方法来检测临床样本中存在的任何病原体、其抗生素抗性基因以及发现新病原体。基于以上特点，mNGS近年来越来越多地应用于临床。当临床遇到疑难或多重感染时，这项技术确实解决了很多难题。但mNGS技术应用中也应注意一些问题：（1）在核酸提取过程中，如果存在多种难以破壁mNGS的微生物，包括分枝杆菌、诺卡氏菌、曲霉属、毛霉属、隐球菌、双相真菌等，破壁相对困难。当检测到的序列数量较少且临床高度怀疑时，应采用其他方法进行相关验证。 （2）MNGS灵敏度好，易受环境微生物、工程菌和不适当的采集工艺的影响。因为mNGS报告需要合理解读，并非所有列出的微生物都应被视为病原微生物。
呼吸道感染病原体检测面临的挑战
呼吸道感染是由许多病毒、细菌或真菌病原体引起的。目前，国内实验室对于常见细菌的诊断技术可能相对成熟，但对于一些罕见细菌感染，如结核分枝杆菌、诺卡氏菌、非结核分枝杆菌、厌氧菌等的诊断能力仍然不足。另外，在真菌方面，除传统的真菌培养外，采用隐球菌荚膜多糖抗原试验和曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）试验提高了诊断率。但在分子生物学诊断方面，目前国内缺乏更好的方法。在COVID-19之前，中国很多医院检测呼吸道病毒的能力较弱，往往采用抗原快速检测方法，甚至选择价值不高但操作相对方便的抗体检测方案。疫情发生后，国内很多二级及以上医院都建立了分子生物学实验室，这使得未来通过分子生物学来识别传染性病原体成为可能。同时，由于呼吸道感染的诊断方法耗时且陈旧，临床医生通常根据经验开出广谱抗生素治疗感染，导致患者抗生素耐药性的出现和蔓延。如果肺炎链球菌引起CAP，起病急、进展快，可导致患者死亡，尤其是儿童患者。传统细菌涂片假阴性普遍存在，且培养和鉴定耗时。另外，肺炎链球菌在采集、运输、培养过程中容易死亡，导致培养阳性率较低。因此，只有快速、准确地诊断呼吸道感染的病原微生物，才能减少抗生素的过度使用，防止耐药率进一步增加，从而达到最佳的临床防治效果。
3 总结与展望
显微镜检查和培养方法在呼吸道感染的诊断中发挥着重要作用，尤其是在免疫功能低下的呼吸道感染样本中，这代表着传统病原检测方法仍然保持金标准水平，且性能不断提高；同时，分子生物学检测技术的进步展现出巨大的前景，有望弥补传统检测方法在灵敏度、特异性、检测时间等多个方面的不足，成为新一代金标准。新旧技术的结合将增强我们更准确、更快速地检测引起肺炎的微生物的能力。可以预见，以分子生物学检测技术驱动的呼吸道病原体感染检测技术未来必然向高通量、自动化方向发展，成为传染病诊断的主要方法。从目前的技术来看，mNGS无法解决病原快速诊断的问题，大多需要24小时甚至更长时间。快速多重PCR大多在2小时内出结果，应用前景广阔。但多重PCR的靶标病原体有限，mNGS对于临床疑难感染有更广阔的应用空间。